La fundación del convento de clarisas se llevó a cabo gracias a la voluntad de María de Padilla, amante de Pedro I el Cruel. Esta mujer de familia noble era natural de Astudillo y por este motivo optó por realizar la fundación en esta población. En 1353 hizo las gestiones pertinentes ante las autoridades civiles y religiosas. Al año siguiente llegó la licencia del papa Inocencio VI y comenzaron las obras, la fundación se formalizó el año 1356. Además de esto, la fundadora dotó económicamente el establecimiento, con bienes y rentas, además el rey Pedro le concedió privilegios.

Tratándose de una fundación real (tenía el título de "Real Monasterio"), el establecimiento estuvo ocupado por monjas procedentes de la nobleza y familias castellanas de importancia. Tuvo una vida próspera durante siglos, aunque con episodios adversos, como una ocupación militar a mediados del siglo XVI. En el siglo XVII la comunidad limitó el número de monjas para poder garantizar su mantenimiento.